Yersinia pestis-Genome enthüllen die Pest in Großbritannien vor 4000 Jahren

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2930 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ausgestorbene Abstammungslinien von Yersinia pestis, dem Erreger der Pest, wurden bei mehreren Individuen aus Eurasien zwischen 5000 und 2500 Jahren vor heute (BP) identifiziert. Eine davon, die sogenannte „LNBA-Linie“ (Spätneolithikum und Bronzezeit), hat sich vermutlich mit menschlichen Gruppen aus der eurasischen Steppe nach Europa ausgebreitet. Hier zeigen wir, dass die LNBA-Seuche bis zur nordwestlichen Peripherie Europas verbreitet wurde, indem wir drei Yersinia pestis-Genome aus Großbritannien sequenzierten, die alle auf ca. 4000 cal BP datiert sind. Zwei Personen stammten aus einer ungewöhnlichen Massenbestattung in Charterhouse Warren, Somerset, und eine Person stammte aus einer Einzelbestattung unter einem Ringsteindenkmal in Levens, Cumbria. Nach unserem Kenntnisstand stellt dies den frühesten bisher dokumentierten Beweis einer LNBA-Plage in Großbritannien dar. Alle drei britischen Yersinia pestis-Genome gehören zu einer Unterlinie, die zuvor bei bronzezeitlichen Individuen aus Mitteleuropa beobachtet wurde, die den mutmaßlichen Virulenzfaktor yapC verloren hatten. Diese Unterlinie wird später in Ostasien etwa 3200 v. Chr. gefunden. Während die Schwere der Krankheit derzeit unklar ist, deutet die weite geografische Verbreitung innerhalb weniger Jahrhunderte auf eine erhebliche Übertragbarkeit hin.

Yersinia pestis ist ein zoonotisches Bakterium, das durch den Biss eines infizierten Flohüberträgers übertragen werden kann und entweder die Beulenpest oder die septische Pest oder über Atemtröpfchen bei Kontakt von Mensch zu Mensch die Lungenpest verursacht. Antike DNA-Analysen haben Yersinia pestis nicht nur als Erreger historischer Epidemien wie der Justinianischen Pest1,2,3 und des Schwarzen Todes4,5 identifiziert, sondern auch bisher unbekannte Beweise für die Verbreitung von Yersinia pestis in der Vorgeschichte identifiziert; Spätneolithische und frühbronzezeitliche (LNBA) Pest wurde in ganz Eurasien im Zeitraum zwischen ca. 4700 und 2800 BP (Jahre vor der Gegenwart) festgestellt6,7,8,9,10,11,12. Der am häufigsten beobachteten LNBA-Linie fehlt der ymt-Virulenzfaktor (LNBA ymt-)11,13. Der erste bekannte Hinweis auf Abstammungslinien mit dem ymt-Gen (LNBA ymt+) wurde bei einem etwa 3800 Jahre alten Individuum (RT5) aus Samara, Russland9 und einem etwa 3300 Jahre alten Individuum (I2470) aus Álava gefunden , Spanien11.

Die LNBA-Abstammungslinien wurden wahrscheinlich etwa 4800 v. Chr. durch menschliche Expansionen mit Ursprung in der eurasischen Steppe nach Mittel- und Westeuropa gebracht6,14,15, und es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese Abstammungslinien zum Niedergang bestimmter spätneolithischer europäischer Gesellschaften beitrugen6,7. Es ist jedoch unklar, wie weit sich die LNBA-Pest in ganz Europa ausgebreitet hat, wobei der westlichste Fund der LNBA-ymt-Linie zuvor im heutigen Süddeutschland etwa 3400 v. Chr. identifiziert wurde11. Menschliche Bewegungen, die mit der Ausbreitung der Bell-Beaker-Kulturen einhergingen, führten aus der Steppe stammende Vorfahren nach Großbritannien und intensivierten die Verbindungen mit Kontinentaleuropa ab ca. 4400 v. Chr.16, was die Möglichkeit eröffnete, dass bronzezeitliche Gruppen aus Nordwesteuropa auch von LNBA-Abstammungslinien von Yersinia pestis betroffen waren. obwohl dies bisher nicht direkt beobachtet wurde.

Hier zeigen wir Hinweise auf LNBA-Yersinia-pestis-Infektionen an zwei Standorten in verschiedenen Regionen Großbritanniens, was darauf hindeutet, dass diese Abstammungslinie nach der Ausbreitung der Populationen nach Westen, deren Vorfahren auf die eurasische Steppe zurückgehen, in ganz Großbritannien weit verbreitet gewesen sein könnte. Die in Großbritannien gefundene LNBA-Linie Yersinia pestis gehört zu einer Klade, die große Verluste ihres Genoms erlitten hat, einschließlich des mutmaßlichen Virulenzfaktors yapC.

Wir haben 34 Individuen an zwei Standorten aus der frühen britischen Bronzezeit – Charterhouse Warren und Levens Park – beprobt, um das Vorkommen von LNBA Yersinia pestis in Großbritannien zu untersuchen. Wir haben Zähne unter alten DNA-Reinraumbedingungen beprobt und doppelt indizierte einzelsträngige DNA-Bibliotheken vorbereitet, die wir mit jeweils 1,8 bis 7,3 Millionen Paired-End-Reads gescreent haben (Methoden). Wir führten eine metagenomische Analyse in Kraken 217 durch und identifizierten Individuen mit einem erheblichen Überschuss an k-meren, die zu Yersinia pestis passen, im Vergleich zur eng verwandten Art Yersinia pseudotuberculosis (Methoden). Diese Analyse identifizierte zwei von 30 auf Pathogen-DNA untersuchten Personen (C10091/1233b und C10098/6265) von der Charterhouse Warren Farm in Somerset, Vereinigtes Königreich (weitere kontextbezogene Details finden Sie unter „Methoden“). Bei der Stätte handelt es sich um eine Massenbestattung abgetrennter menschlicher Überreste, die wahrscheinlich in einem einzigen Ereignis zusammen in einem natürlichen Schacht deponiert wurden. Die beiden untersuchten Zähne stammten von Kindern im Alter von 12 ± 3 Jahren bzw. 10 ± 3 Jahren. Der mit dem C10098-Zahn (6265/10 Jahre altes Kind) verbundene Unterkiefer wurde direkt mit Radiokarbon auf 4145–3910 cal BP datiert (95,4 % Konfidenz; OxA-37840: 3685 ± 30 BP, kalibriert in OxCal v4.418 unter Verwendung von IntCal2019). ), im Einklang mit zwei zuvor veröffentlichten Radiokarbondaten auf menschlichen Knochen aus dieser Ansammlung20. Es kann davon ausgegangen werden, dass die andere Person aus einem ähnlichen Alter stammt.

Darüber hinaus identifizierte unsere Analyse Yersinia pestis bei einem von vier Individuen, die aus dem Ringsteindenkmal Levens Park in Levens, Cumbria, Vereinigtes Königreich geborgen wurden21,22 (siehe Methoden für detaillierten archäologischen Kontext). Ein vollständiges und drei zerstörte Skelette (Bestattungen 1, 2, 3 und 4) wurden aus dem Denkmal geborgen und alle wurden direkt auf ca. datiert. 4300–3700 cal BP. Wir entdeckten Yersinia pestis in einem Zahn aus Beerdigung 2 (C10928), einer 35–45 Jahre alten Frau, die in geduckter Haltung aus einem mit Brettern ausgekleideten Grab (möglicherweise einem Holzsarg) geborgen wurde und von Becherkeramikscherben begleitet wurde. Das Skelett wurde direkt auf 4065–3780 cal BP datiert (95,4 % Konfidenz, GU-51281: 3602 ± 33 BP22). Ein Vergleich dieses Radiokarbon-Datums mit dem aus Charterhouse C10098 erhaltenen Datum legt nahe, dass wir die Möglichkeit nicht ausschließen können, dass diese beiden Personen ungefähre Zeitgenossen waren (χ2-Test, df = 1, T = 2,746 (5 % 3,841)).

Diese Ergebnisse von mehreren Standorten zeigen, dass sich Yersinia pestis während der Bronzezeit nach Großbritannien ausgebreitet hatte (Abb. 1A). Wir stellen jedoch fest, dass die Häufigkeit des Auftretens von Yersinia pestis unbekannt bleibt und niedriger sein könnte als die beobachtete Häufigkeit an den beiden Standorten. Die Falsch-Negativ-Rate beim Nachweis von Yersinia pestis in archäologischen Überresten ist unbekannt, aber wahrscheinlich hoch23, daher können wir nicht ausschließen, dass andere Personen an den Standorten infiziert waren.

Eine in IQ-TREE v.1.6.1229 erstellte Maximum-Likelihood-Phylogenie mit 1000 Bootstrap-Replikaten unter Verwendung des TVMe+ASC-Substitutionsmodells, einschließlich zuvor veröffentlichter LNBA-Genome (Ergänzungstabelle 1), die die Filterkriterien (Methoden) erfüllten, sowie die beiden Charterhouse Warren-Genome aus dieser Studie. Die Phylogenie umfasst auch das Referenzgenom 1.ORI CO92 (NC_003143.1) und hat seinen Ursprung in IP32881 Yersinia pseudotuberculosis (nicht in der Abbildung enthalten). Die Zahlen geben den Prozentsatz der Bootstrap-Replikate an, die diesen Knoten unterstützen. Die orangefarbenen Zweige bezeichnen die LNBA-ymt-Linie (lila Spitzen zeigen Individuen aus dieser Studie, orangefarbene Spitzen zeigen veröffentlichte Genome, die zur LNBA-ymt-Linie gehören) und die türkisfarbenen Zweige und Spitzen bezeichnen die LNBA-ymt+-Linie. Der graue Spitzenknoten weist auf die neolithische Belastung hin. B Cladogramm, das eine Maximum-Likelihood-Phylogenie zeigt, die das Genom C10928 mit geringerer Abdeckung aus Levens Park (LP) einschließt und es in die Nähe der Charterhouse Warren (CW)-Stämme C10091 und C10098 bringt. C Chronologie der in (A) enthaltenen Yersinia pestis-Genome mit Ausnahme von C10091. Direkt an den Individuen vorgenommene Radiokarbondaten wurden in OxCal v4.4.4 unter Verwendung von IntCal2018, 19 (Ergänzungstabelle 3) kalibriert. D Karte, die die Verbreitung von LNBA- und neolithischen Yersinia pestis-Stämmen zeigt. Punkte in Lila zeigen Genome, die in dieser Studie neu sequenziert wurden. Lila und orangefarbene Punkte stellen LNBA-ymt-Genome dar, was auf das Fehlen des ymt-Gens hinweist, und türkisfarbene Punkte stellen LNBA-ymt+-Genome dar (mit vorhandenem ymt). Graue Punkte zeigen neolithische Stämme von Yersinia pestis, denen ebenfalls das ymt-Virulenzgen fehlt. Karte erstellt in R mit dem Paket „maps“ und ggplot2.

Wir haben die Illumina NovaSeq-Plattform verwendet, um direkte Shotgun-Sequenzierungsdaten von ca. 768 Millionen bzw. ca. 322 Millionen Lesepaaren von den Individuen C10098 bzw. C10091 von Charterhouse Warren zu generieren (Tabelle 1), nach Größenauswahl zur Anreicherung von Molekülen mit mindestens 35 bp length24 (Methoden). Das Individuum aus Levens Park (C10928) war für die Shotgun-Sequenzierung nicht geeignet, aber die Bibliotheken dieses Individuums sowie der beiden anderen Individuen wurden zwei Runden der Hybridisierungserfassung mit einem Ansatz zur Zielanreicherung in Lösung unter Verwendung von Yersinia pestis-RNA-Ködern (Daicel) unterzogen Arbor Biosciences). Die Zusammenführung der Daten aus der direkten Shotgun-Sequenzierung und den gezielten Anreicherungsexperimenten ergab eine durchschnittliche 8,4-fache, 6,1-fache und 3,3-fache Abdeckung des Yersinia pestis-Genoms für C10091, C10098 bzw. C10928, wenn sie mit der Kartierungsqualität von MQ1 gefiltert wurden (Tabelle 1). Alle drei Genome zeigten Hinweise auf Authentizität: 25 postmortale Schäden, eine abnehmende Anzahl beobachteter Sequenzen als Funktion des Bearbeitungsabstands zum Referenzgenom, eine unimodale Fragmentlängenverteilung und eine relativ gleichmäßige Abdeckungsbreite über das Genom (ergänzende Abbildung 1). und Abb. 2A).

Wir haben die Genome aus dieser Studie und zuvor veröffentlichte neolithische Yersinia pestis- und LNBA-Genome6,7,8,9,10,11,12,26 (Ergänzungstabelle 1) mit dem heutigen Yersinia pestis-Genom 1.ORI CO92 (NC_003143.1) abgeglichen )27 und richtete den Yersinia pseudotuberculosis-Stamm IP3288128 auf die gleiche Weise aus (Methoden). Wir behielten eine Teilmenge der Genome bei, die einen hohen Grad an aufgerufenen Stellen aufwies, wobei die Mindestsequenztiefe pro Stelle bei allen veröffentlichten Genomen bei drei und bei den in der hauseigenen Einzelstrangbibliothek sequenzierten Genomen bei mindestens fünf lag (Methoden). . Wir führten eine phylogenetische Inferenz mit IQ-TREE29 durch, bewerteten die Unsicherheit mit 1000 Bootstrap-Replikaten und verwurzelten die Phylogenie mit Y. pseudotuberculosis in FigTree. Unsere endgültige Phylogenie bestand aus 27 alten veröffentlichten Genomen und den beiden Charterhouse Warren-Individuen (C10091 und C10098) aus dieser Studie. Wir fanden heraus, dass in der rekonstruierten Phylogenie die Genome von Charterhouse Warren Yersinia pestis in die breitere LNBA-Ymt-Klade fallen. In der asymmetrischen Klade der LNBA-ymt-Genome, die grob nach Chronologie gruppiert sind11, fanden wir heraus, dass die britischen Genome von Genomen aus der Tschechischen Republik (HOP001 und HOP004) abgeleitet sind, die auf ~4300 cal BP und ~4250 cal BP datieren. aber basal zu einem Genom aus Russland, das auf ca. 4200 cal BP datiert (KLZ001)11. Tatsächlich stimmt die Topologie der zuvor veröffentlichten Genome mit zuvor rekonstruierten Phylogenien überein. Wir platzierten auch das Genom mit geringerer Abdeckung aus Levens Park (C10928) in einer reduzierten Phylogenie, die die Genome von Charterhouse Warren und Genome mit hoher Abdeckung aus benachbarten Gruppen umfasste (Methoden) (Abb. 1B) und stellten fest, dass es wahrscheinlich eng damit verwandt war die von Charterhouse Warren.

Die beiden Genome von Charterhouse Warren weisen zwei Transversionsfehlpaarungen von 939.710 Standorten mit einer minimalen Sequenztiefe von 5 auf (eine Fehlpaarungsrate von 0,0002 %). Beide sind auf offensichtliche Veränderungen im C10091-Genom zurückzuführen und befinden sich bei Ausrichtung auf das CO92-Referenzgenom (NC_003143.1) nebeneinander an den Positionen 2227793 und 2227794. Während BlastN-Suchen im NCBI-Nukleotidarchiv ergaben, dass alle Sequenzen Yersinia pseudotuberculosis und Yersinia pestis als oberste Übereinstimmung aufwiesen, lagen die beobachteten Transversionen neben einer Insertion (eine weitergelesene Sequenz enthielt eine Deletion), und es scheint daher möglich, dass sie falsch waren Ausrichtung aus einer in der Datenbank nicht charakterisierten Quelle (Ergänzungsabbildung 2, Ergänzungstabelle 230).

Wir suchten nach größeren Deletionen, indem wir die Sequenztiefe in den Genomen von Charterhouse Warren mit höherer Abdeckung beurteilten (Methoden). Wir haben keine neuen Deletionen identifiziert, die größer als 1000 bp sind, aber das zuvor identifizierte „Ereignis 1“, die älteste Deletion in LNBA-Stämmen, die zum Verlust einer 36-kb-Region führte und bei mehreren zuvor sequenzierten Individuen beobachtet wurde8,11, wird ebenfalls beobachtet sowohl im Charterhouse Warren- als auch im Levens Park-Genom. Der Verlust dieser Region führte zum Verlust des yapC-Virulenzgens, von dem in vitro gezeigt wurde, dass es die Adhäsion in kultivierten Zellen vermittelt und somit die Kolonisierungsfähigkeit von Yersinia pestis während einer Infektion verbessert haben könnte31.

Wir beobachten das Vorhandensein und Fehlen anderer funktioneller Elemente, die alle mit der phylogenetischen Platzierung der britischen Yersinia pestis-Genome übereinstimmen. Wir bestätigen das Fehlen des filamentösen Prophagen, der in allen veröffentlichten neolithischen und LNBA-Genomen fehlt und heute hauptsächlich in 1.ORI-Stämmen identifiziert wird32. Das Fehlen und Vorhandensein zuvor gemeldeter Virulenzfaktoren auf den britischen Yersinia pestis-Plasmiden stimmt alle mit zuvor veröffentlichten LNBA-ymt-Plasmiden überein (Abb. 2B). UreD, das mit einer erhöhten Flohtoxizität assoziiert ist33, pde-2, das am Herunterregulierungsmechanismus für die Biofilmbildung beteiligt ist34 und flhD, dessen Inaktivierung mit einer Immuninvasion assoziiert ist35, zeigen alle Variationen, die mit keinem Funktionsverlust in den Genomen von Charterhouse Warren übereinstimmen (Methods )9.

A Circos stellt die Bedeckung (MQ30) über das Yersinia pestis-Chromosom CO92 und die Plasmide pMT1, pCD1 und pPCP1 dar, wobei Blau C10091, Orange C10098 und Rosa C10928 darstellt. Zur Berechnung der durchschnittlichen Tiefe wurden 500-bp-Fenster für das Chromosom, 100-bp-Fenster für die Plasmide pMT1 und pCD1 und 10-bp-Fenster für pPCP1 verwendet. Zusätzlich haben wir die Region zwischen 3000 und 4200 bp auf dem pPCP1-Plasmid (*) manuell maskiert, wie in einer früheren Studie59. B Heatmap des abgeleiteten Vorhandenseins/Fehlens von Virulenz-assoziierten Genen, bewertet durch normalisierte Abdeckungstiefe über das Yersinia pestis-Chromosom und die Plasmide pCD1, pMT1 und pPCP1, wobei Lila zu 100 % vorhanden ist, Orange (Mittelpunkt) zu 50 % vorhanden ist und Gelb 0 % vorhanden sein (Methoden).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Linie LNBA ymt-Yersinia pestis nicht auf das bronzezeitliche Kontinentaleuropa beschränkt war, sondern sich nach Westen bis nach Großbritannien ausgebreitet hatte. Wir zeigen, dass die Genome von Yersinia pestis in Großbritannien enge Ähnlichkeiten mit den Genomen der Bronzezeit im heutigen Deutschland hatten, die möglicherweise durch menschliche Ausbreitungen eingeführt wurden, die bis in die eurasische Steppe zurückreichen. Unsere Ergebnisse zeigen zusammen mit zuvor veröffentlichten Genomen, dass der LNBA-ymt-Stamm von Yersinia pestis im Zeitraum zwischen ca. 4700 und 2800 v. Chr. in ganz Eurasien, von Großbritannien bis Ostasien, weit verbreitet war. Die Entfernung zwischen den Standorten Levens Park und Charterhouse Warren im Nordwesten bzw. Südwesten Englands und ihre statistisch nicht unterscheidbaren Radiokarbondaten könnten auf die weitverbreitete Verbreitung von LNBA ymt-Yersinia pestis-Stämmen auch in ganz Großbritannien hinweisen.

Den Personen aus dieser Studie fehlt allen das ymt-Virulenzgen, von dem bekannt ist, dass es eine wichtige Rolle bei der flohvermittelten Übertragung gespielt hat. Der früheste bekannte Yersinia pestis-Stamm, der das ymt-Gen trägt, wurde in der Samara-Region im westlichen Teil der eurasischen Steppe gefunden und stammt aus dem Jahr 3800 BP9. Dies liegt zeitlich nahe an unseren beiden Yersinia pestis-Genomen aus Großbritannien und liefert weitere Belege für unterschiedliche zeitgenössische Häufigkeiten des ymt-Gens über eine noch größere geografische Entfernung. Das ymt-Gen ermöglicht zusammen mit dem hms-Gen das Überleben und die Kolonisierung der Bakterien im Mitteldarm und Proventriculus von Flöhen und ermöglicht so eine flohvermittelte Übertragung36,37,38. Die Forschung hat jedoch auch ein Frühphasenübertragungsmodell vorgeschlagen, das nicht die gesamte extrinsische Inkubationszeit für eine flohvermittelte Übertragung erfordert39. Es wurde auch vermutet, dass das ymt-Gen bei der flohvermittelten Übertragung von braunem Rattenblut eine geringere Rolle spielt als bei Blut von Mäusen, Menschen oder schwarzen Ratten40.

Hinsichtlich des Umfangs der Ablagerungen und der Beweise für umfangreiche Traumata ist Charterhouse Warren ein seltener Ort im Kontext des frühbronzezeitlichen Europas41. Es ist klar, dass die bei der Massenbestattung im Charterhouse vertretenen Personen einer nicht normativen Form der Bestattungsbehandlung unterzogen wurden, und es liegt nahe, anzunehmen, dass diese ungewöhnliche Behandlung eine spezifische Reaktion auf einen lokalen Pestausbruch gewesen sein könnte, ähnlich wie die Massengräber, die im gesamten mittelalterlichen Europa als Reaktion auf die Pestepidemie auftauchten42. Hinweise auf ein tödliches Trauma unter der Versammlung von Charterhouse Warren (RJS, T. FC., JO, Christophe Snoeck, Fiona Brock, LL, TA, Don Walker, in Vorbereitung) machen es jedoch unwahrscheinlich, dass diese Massenbestattung auf einen tödlichen Ausbruch zurückzuführen ist der Pest. Dennoch können wir eine höhere Prävalenz der Pest bei den verbleibenden 28 Personen dieser Stätte nicht vollständig ausschließen, da aufgrund von Faktoren wie der schlechten Erhaltung der endogenen mikrobiellen DNA und der variablen Krankheitserregerbelastung falsch-negative Ergebnisse möglich sind, was den Nachweis alter Krankheitserreger erschwert23. Dies wirft die Frage auf, die wir an dieser Stelle nicht beantworten können, ob es möglicherweise einen Zusammenhang zwischen der Krankheit und der gewaltsamen Behandlung dieser Personen gegeben hat. Mindestens einer der beiden Unterkiefer des Kindes weist Anzeichen eines Perimortemtraumas auf, obwohl der disartikulierte Zustand der Überreste bedeutet, dass ein mögliches Trauma des restlichen Skeletts nicht beurteilt werden kann. Das Vorhandensein von Yersinia pestis-DNA in den beiden Kindern lässt darauf schließen, dass sie entweder erkrankt waren, als ihnen ein Trauma zugefügt wurde, oder alternativ, dass das Trauma nach ihrem Tod durch die Pest zugefügt wurde. Das letztgenannte Szenario lässt sich nicht gänzlich von der Hand weisen, obwohl es angesichts der in der Gesamtgruppe beobachteten Rate an Perimortemtraumata unwahrscheinlich ist, was darauf hindeutet, dass die meisten oder alle Personen während eines bestimmten Gewaltereignisses getötet wurden. Im Gegensatz dazu stellt die Beerdigung 2 aus dem Ringhaufen von Levens Park einen viel normativeren Bestattungsritus für diesen Zeitraum dar22. Um diese Fragen zu beantworten und die Übertragungsdynamik und funktionelle Entwicklung von Yersinia pestis in Großbritannien und darüber hinaus besser zu verstehen, sind weitere hochauflösende Probenahmen erforderlich.

Alle Radiokarbondaten wurden in OxCal 4.4 unter Verwendung der IntCal20-Kalibrierungskurve18,19 kalibriert. Es gibt keine stabilen Kohlenstoff- und Stickstoffisotopennachweise für einen nachweisbaren Eintrag von Meeres- oder Süßwassernahrungsmitteln, die eine Korrektur der Reservoireffekte erfordern würden.

Charterhouse Warren ist ein natürlicher Schacht im Kalkstein der Mendip Hills, Somerset. In den 1970er Jahren wurden erste Ausgrabungen durchgeführt, um festzustellen, ob der Schacht zu einem Höhlensystem führte, da zu diesem Zeitpunkt keine archäologischen Überreste von der Stätte bekannt waren. Die Ausgräber stellten das Vorhandensein von menschlichen und tierischen Knochen in getrenntem Zustand fest, von denen einige Schnittwunden und Nagetierfraß aufwiesen43. Die Ansammlung menschlicher Überreste, die auf aDNA untersucht wurden, wurde in einer bestimmten Schicht bei ca. 15 m Tiefe, zusammen mit Tierresten und einer kleinen Anzahl von Artefakten, darunter Scherben eines Becherglasgefäßes. Mindestens 40 Männer, Frauen und Kinder sind durch fragmentierte und disartikulierte Überreste dargestellt. Kulturell und chronologisch stammt die Ansammlung aus der späten Becherzeit/frühen Bronzezeit, ca. 4150–3950 cal BP. Hierbei handelt es sich um einen nicht normativen Bestattungskontext für diesen Zeitraum, der von Einzelbestattungen in Verbindung mit Grabdenkmälern und Friedhöfen dominiert wird. Veränderungen, die an einem erheblichen Teil der Knochen festgestellt wurden, deuten darauf hin, dass viele, wenn nicht alle dieser Personen einem tödlichen Perimortemtrauma und einer anschließenden Bearbeitung ausgesetzt waren, bevor disartikulierte Knochen zusammen im Schaft abgelagert wurden, was jedoch wahrscheinlich ein einziges Ereignis war Die Analyse der Zusammenstellung und Modellierung der Radiokarbondaten ist im Gange. Während man im bronzezeitlichen Großbritannien manchmal auf disartikulierte Überreste stößt, ist das Ausmaß der Ablagerungen in Charterhouse Warren im britischen Kontext einzigartig, was darauf hindeutet, dass es sich um ein sehr ungewöhnliches Ereignis handelt. Die Hinweise auf ein perimorales Trauma durch stumpfe Krafteinwirkung an einer Reihe von Schädeln sowie Hinweise auf eine Zerstückelung legen nahe, dass dies mit einer Episode extremer Gewalt zusammenhängen könnte.

Der Ringhaufen von Levens Park in Levens, Cumbria, Großbritannien, bestehend aus einem niedrigen, mit Bordsteinen versehenen Hügel, unter dem sich weitere Ringe aus Felsbrocken oder wandähnlichen Strukturen befanden, wurde zwischen 1968 und 1971 von David Sturdy21 ausgegraben. Die Untersuchung des vorhandenen Archivmaterials durch Mitglieder der Levens Local History Group hat kürzlich zu einer Neubewertung der Ausgrabung geführt, die zu einem detaillierteren Verständnis des Denkmals und seines Zwecks geführt hat22. Wir geben hier einen allgemeinen Überblick über den Standort, siehe jedoch Clare et al.22 für Einzelheiten zu den damit verbundenen Unsicherheiten. Vier Skelette (Bestattungen 1, 2, 3 und 4) wurden aus dem Denkmal geborgen und repräsentieren zwei getrennte Phasen der Bestattungstätigkeit. Bei der Beerdigung 4 handelte es sich um eine unbegleitete, geduckte Bestattung eines 25–45-jährigen Mannes, bedeckt mit einem großen Felsbrocken, aber ohne dazugehörige Artefakte. Das Skelett wurde mit Radiokarbon auf 4229-3976 cal BP datiert (95 % Konfidenz, 3731 ± 34 BP, GU-51283), deutlich früher als die Daten der anderen drei Skelette (R_Combine χ2 Test in OxCal 4.4: df = 3, T = 11,2 (5 %, 11,8))18,19. Die Bestattungen 1, 2 und 3 wurden aus einer größeren angrenzenden Struktur innerhalb des Denkmals geborgen. Ihre Radiokarbondaten waren statistisch nicht zu unterscheiden, was darauf hindeutet, dass sie etwa zur gleichen Zeit oder innerhalb weniger Jahrzehnte voneinander gestorben sein könnten (R_Combine χ2 Test in OxCal 4.4: df = 2, T = 0,7 (5 %, 6,0));18,19 Bei der Beerdigung 2, die aufgrund ihrer Lage in der Mitte des neuen Bauwerks vermutlich die Hauptbestattung in dieser Phase darstellt, handelte es sich um eine 35–45-jährige Frau, die in geduckter Haltung aus einem mit Brettern ausgelegten Grab geborgen wurde (möglicherweise). ein Holzsarg) und begleitet von Scherben von Becherkeramik. Das Skelett wurde direkt auf 4065–3780 cal BP datiert (95 % Konfidenz, 3602 ± 33 BP, GU-51281). Beerdigung 1, eine 17–35-jährige Frau aus der Zeit um 4080–3840 v. Chr., 95 % Konfidenz, 3626 ± 33 v. Chr., GU-51280) und Beerdigung 3, eine wahrscheinlich erwachsene Frau aus der Zeit um 3982–3879 v. Chr. ( 95 % Konfidenz, 3587 ± 33 BP, GU-51282) wurden aus der Cairn-Matrix gewonnen und ihr ursprünglicher Charakter und ihre Assoziationen sind unklar. Strontium- und Sauerstoff-Stabilisotopenanalysen der Bestattungen 1, 3 und 4 stimmen mit der Annahme überein, dass sie lokal gewachsen sind, obwohl die Ergebnisse auch mit einem Ursprung in anderen Teilen Großbritanniens übereinstimmen würden, ebenso mit Bestattung 2.

Die Proben wurden am Francis Crick Institute in einer speziellen Reinraumanlage verarbeitet. Wir verwendeten einen EV410-230 EMAX Evolution Dentistry-Bohrer, um die Oberfläche der Zähne zu reinigen und Proben sowohl des Zements als auch mehrerer Fraktionen des Dentins zu entnehmen, was zu 7–25 mg Pulver aus dem Dentin führte. Dentinpulver wurden dann mit 300 µl (<10 mg Pulver), 600 µl (10–25 mg) oder 1000 µl (>25 mg Pulver) Lysepuffer (0,5 EDTA pH 8,0, 0,05 % Tween-20, 0,25) lysiert mg/ml Proteinase K44) und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Lysate wurden 2 Minuten lang bei einer maximalen Geschwindigkeit von 16.400 × g (13.200 U/min) in einer Tischzentrifuge zentrifugiert und 140 µl des Lysats wurden zur automatischen Extraktion auf einer Agilent Bravo Workstation45 in FluidX-Röhrchen überführt. Die Extrakte wurden in einzelsträngige DNA-Bibliotheken umgewandelt24, dann doppelt indiziert46 und einer Paired-End-Sequenzierung auf einer Illumina HiSeq4000- oder NextSeq500-Plattform unterzogen, was zu 1,8 bis 7,3 Millionen Lesepaaren pro Probe für das erste Screening führte. Alle Proben wurden zusammen mit negativen Lysat- und Extraktionskontrollen sowie positiven und negativen Bibliothekskontrollen verarbeitet.

Nach dem ersten Erregernachweis wurden die Bibliotheken zur Zielanreicherung mit Yersinia pestis-Ködern weitergeleitet, die von myBaits Arbor Biosciences gemäß dem High Sensitivity-Protokoll47 von myBaits Custom RNA Seq v5.1 (März 2021) entwickelt wurden. Wir verwendeten 7 μl der ursprünglichen Bibliothek für zwei Hybridisierungsrunden bei 55 °C mit 23-stündiger Inkubation über Nacht und 20 PCR-Zyklen, gefolgt von einer Heteroduplex-Entfernung mithilfe einer Ein-Zyklus-PCR und MinElute Purification (Qiagen)-Reinigung. Wir haben jede Bibliothek mit einer 2 × 100 Paired-End-Lesekonfiguration auf den Illumina MiSeq- und NovaSeq-Plattformen sequenziert (Tabelle 1).

Vor der direkten Shotgun-Sequenzierung in größerem Maßstab wurden Fragmente, die kürzer als 35 bp und länger als 150 bp waren, aus den Bibliotheken entfernt, wie bei Gansauge et al.24. Konkret wurden 100 ng der ursprünglichen Bibliothek biotinyliert und Streptavidin-Kügelchen wurden verwendet, um den nicht biotinylierten Strang zu isolieren und eine einzelsträngige Bibliothek zu erhalten. Diese Proben (gepoolt mit drei anderen) wurden dann zusammen mit 35-bp- und 150-bp-Insert-Markern auf ein denaturierendes Polyacrylamidgel geladen, und Fragmente innerhalb der gewünschten Sequenzlänge wurden physikalisch herausgeschnitten und nach Inkubation über Nacht aus dem Gel eluiert. Die resultierenden größenselektierten Bibliotheken wurden weiter amplifiziert und auf dem Illumina NovaSeq sequenziert (Tabelle 1).

Die Proben wurden über die nf-core/eager v2-Pipeline48 verarbeitet. Zuerst wurden Adapter entfernt, Paired-End-Lesevorgänge zusammengeführt und Basen mit einer Qualität unter 20 mit AdapterRemoval v249 mit –trimns –trimqualities –collapse –minadapteroverlap 1 und –preserve5p gekürzt. Zusammengeführte Lesevorgänge mit einer Mindestlänge von 35 bp wurden mit dem Burrows-Wheeler Aligner (BWA-0.7.17 aln)50 unter Verwendung der folgenden Parameter „-l 16500 -n 0,01“51,52 auf das menschliche Referenzgenom hs37d5 abgebildet.

Wir analysierten mit Kraken 217 Sequenzen, die sich nicht erfolgreich an das menschliche Genom anpassten, und identifizierten Personen als mutmaßlich positiv für Yersinia pestis, indem wir die Anzahl der beobachteten k-mers (Sequenzübereinstimmungen) mit Yersinia pestis im Vergleich zu Yersinia pseudotuberculosis bewerteten. Diese Bibliotheken wurden anschließend mit dem CO92 Yersinia pestis-Referenzgenom (NC_003143.1) und den CO92-Plasmiden pMT1 (NC_003134.1), pCD1 (NC_003131.1) und pPCP1 (NC_003132.1) unter Verwendung der BWA aln50-Parameter „-l“ abgeglichen 16500 -n 0,01 -o 2". Duplikate wurden entfernt, indem nur die erste Sequenz aus allen Sequenzen mit derselben Startposition und Länge beibehalten wurde (https://github.com/pontussk/samremovedup). Wir haben die Authentizität des endgültigen Satzes von Sequenzen anhand der folgenden Kriterien bewertet:25 der Beobachtung postmortaler Schäden, wobei die Anzahl der Sequenzen negativ mit der Bearbeitungsentfernung vom Referenzgenom korreliert, und einer unimodalen Fragmentlängenverteilung über DamageProfiler53. Darüber hinaus haben wir SAMTools v1.3.1 Depth54 verwendet, um eine gleichmäßige Abdeckung im gesamten Referenzgenom zu bestätigen. Screening-Bibliotheken, die diese Authentifizierungskriterien erfüllten, wurden zur weiteren Schrotflinten-Sequenzierung und Zielanreicherung weitergeleitet. Für die endgültigen BAM-Dateien haben wir die mit Schrotflinten und Zielen angereicherten BAM-Dateien mit samtools merge zusammengeführt, was zu einer endgültigen Abdeckung von 8,4x, 6,1x und 3,3x für C10091, C10098 bzw. C10928 führte, wenn nach einer Mindestkartierungsqualität von q1 gefiltert wurde ( MQ1) (Tabelle 1, Abb. 2A, ergänzende Abb. 1).

Wir verwendeten zuvor identifizierte Virulenzgene11 auf dem Yersinia pestis-Chromosom sowie die Plasmide pCD1, pMT1 und pPCP1 und analysierten die Abdeckung dieser Gene mit BEDTools v2.29.255 (Abb. 2A). Das ggplot256-Paket in R wurde dann verwendet, um eine farbige Heatmap des Prozentsatzes der Positionen in jedem Virulenzgen zu erstellen, die von mindestens einer Sequenz abgedeckt werden. Darüber hinaus verwendeten wir BEDTools v2.29.255 genomecov, um das Fehlen im gesamten Genom zu bewerten und Regionen zu identifizieren, die bei den beiden Charterhouse-Individuen größer als 1 kb waren. Einige Unterschiede in der Abdeckung des Yersinia pestis-Chromosoms zwischen den vorgefertigten Arbor-RNA-Fangködern im Vergleich zu Schrotflintendaten können in direkten Vergleichen beobachtet werden, höchstwahrscheinlich aufgrund der bevorzugten Erfassung einiger Teile des Chromosoms gegenüber anderen mit dem Ködersatz (ergänzende Abbildung). . 3). Wir sehen jedoch keine Hinweise darauf, dass daraus Rückschlüsse auf größere Deletionen oder Funktionsverluste gezogen werden könnten. Wir haben die Gene ureD, pde-2 und flhD manuell untersucht, um das Vorhandensein von Indels und SNPs zu identifizieren, die für diese Gene spezifisch sind, und um zu beurteilen, ob sie in den Genomen von Charterhouse Warren funktionsfähig waren oder nicht9. Allerdings war die Abdeckung für C10928 zu gering, um diese Indels zu bewerten.

Wir haben die beiden Charterhouse-Warren-Genome verglichen, um Transversions-SNPs bei unterschiedlichen Basisfaltenabdeckungen zu identifizieren (ergänzende Abbildung 2, ergänzende Tabelle 2), nachdem wir mit samtools Calmd54 nach einer Kartierung und Basisqualität von 30 gefiltert und heterozygote Stellen mithilfe eines internen Skripts entfernt hatten (https://github.com/pontussk/mpileup_mismatch_pathogen.py).

Zuvor veröffentlichte Daten aus Genomen der Pest aus der Bronzezeit und der Jungsteinzeit sowie dem IP32881-Stamm von Yersinia pseudotuberculosis wurden aus dem Europäischen Nukleotidarchiv (Ergänzungstabelle 1) heruntergeladen und unter Verwendung derselben Parameter wie die in dieser oben beschriebenen Studie generierten Daten (Bioinformatische Verarbeitung) verarbeitet Ausnahme der Duplikatentfernung, bei der Duplikate mit derselben Startposition unabhängig von der Länge entfernt wurden, um eine Anpassung an die Single-End-Sequenzierung in veröffentlichten Daten vorzunehmen.

Nach der Entfernung doppelter Lesevorgänge verwendeten wir ein internes Skript (https://github.com/pontussk/mpileup2consensus.py), um nur homozygote Websites mit einem Basisqualitätswert von Q30 zu behalten und so alle heterozygoten Websites und kleinen Websites (kürzer als) auszuschließen eine Sequenz (Leselänge), Einfügungen oder Löschungen und eine maximale Bearbeitungsentfernung von 90 % mit samtools Calmd54. Anschließend haben wir alle Standorte gefiltert, um nur Standorte mit einer mindestens dreifachen Basenabdeckung zu behalten, um eine Konsenssequenz für alle veröffentlichten Genome und eine fünffache Abdeckung für die Charterhouse-Warren-Genome zu erhalten.

Anschließend wurden die Konsenssequenzen gefiltert, um nur polymorphe Stellen innerhalb des Sequenzsatzes zu behalten, der für die Eingabe in die Phylogenie verwendet wurde. Dabei wurden alle Übergänge entfernt, um die Auswirkungen der Cytosin-Desaminierung in den alten DNA-Sequenzen zu beseitigen. Für die Hauptphylogenie (Abb. 1A) haben wir Individuen ausgeschlossen, bei denen mehr als 70 % im gesamten Genom fehlten, und Stellen entfernt, die bei mehr als 20 % der verbleibenden Individuen fehlten, was zu 2306 Transversions-SNPs führte, die an IQ-TREE weitergeleitet wurden v.1.6.1229. Wir haben Modelltests mit dem ModelFinder in IQ-TREE57 implementiert, was ein TVMe+ASC als am besten geeignetes Modell gemäß dem Akaike-Informationskriterium für beide Phylogenien in Abb. 1A und Abb. 1B vorschlug. Wir haben 1000 Bootstrap-Replikate für die Phylogenie in Abb. 1A implementiert und die Maximum-Likelihood-Phylogenie in FigTree58 mit der Außengruppe Yersinia pseudotuberculosis (IP32881) verwurzelt (die Außengruppe ist in der Abbildung nicht dargestellt, um die Sichtbarkeit der LBNA-Kladen in Abb. 1A zu erhöhen). ).

Aufgrund der geringen Abdeckung wurde eine separate phylogenetische Inferenz zur Positionierung des Levens-Park-Genoms C10928 verwendet. Hier haben wir die gefilterten Konsensussequenzen der LNBA-Stämme, die topologisch nahe an der monophyletischen Charterhouse Warren-Gruppe (C10091 und C10098) lagen, genommen und sie auf eine minimale Basenabdeckung von 3 gefiltert, wobei nur Transversionen und Standorte in mindestens 70 vorhanden waren % der Genome (unabhängig davon, ob in den Genomen etwas fehlt). Dies führte dazu, dass 104 SNPs an IQ-TREE weitergeleitet wurden, wobei ein TVMe+ASC-Modell mit 100 Bootstrap-Replikaten verwendet wurde. Die Maximum-Likelihood-Phylogenie wurde in FigTree58 basierend auf Abb. 1A verwurzelt und in das Kladogramm in Abb. 1B umgewandelt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Sequenzierungsdaten wurden im Europäischen Nukleotidarchiv (ENA) am EMBL-EBI unter der Zugangsnummer PRJEB61230 hinterlegt.

Der in dieser Studie verwendete Code wird unter https://github.com/pontussk/ zur Verfügung gestellt.

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Wir danken der Advanced Sequencing Facility und Chris Barrington von der Bioinformatics and Biostatistics Science Technology Platform am Francis Crick Institute für technische Unterstützung. P. Sk. wurde von der Vallee Foundation, dem European Research Council (Fördernummer 852558), der European Molecular Biology Organisation, dem Wellcome Trust (217223/Z/19/Z) und der Kernfinanzierung des Francis Crick Institute (FC001595) von Cancer Research UK unterstützt , dem UK Medical Research Council und dem Wellcome Trust. MH wurde von Marie Skłodowska Curie Actions (Fördernummer 844014) unterstützt. Osteologische Analysen des menschlichen Skelettaufbaus von Charterhouse Warren wurden von der British Academy (SG163375) unterstützt. Die Finanzierung der Radiokarbondatierung erfolgte über das NEIF-Programm des NERC (NF/2018/1/3) an RS. Wir danken Allan Steward und der Levens Local History Group dafür ihre Mitarbeit an diesem Projekt. Die archäologischen Arbeiten im Levens Ring Cairn wurden durch ein CWAAS-Stipendium an die Levens Local History Group (an TC, GC, IH, M. Simpson, SR) unterstützt. Diese Forschung wurde ganz oder teilweise vom Wellcome Trust (FC001595 und 217223/Z/19/Z) finanziert. Wir möchten uns auch bei Gunnar Neumann und der SPAAM-Community für Hilfe und Ratschläge bedanken. Für die Zwecke des Open Access hat der Autor eine öffentliche CC BY-Urheberrechtslizenz auf alle vom Autor akzeptierten Manuskriptversionen angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergeben.

Open-Access-Förderung durch das Francis Crick Institute.

Verstorben: Stephen Read.

Ancient Genomics Laboratory, Francis Crick Institute, London, Großbritannien

Pooja Swali, Alexandre Gilardet, Monica Kelly, Kyriaki Anastasiadou, Isabelle Glocke, Jesse McCabe, Mia Williams, Tom Davy, Marina Silva, Mateja Hajdinjak, Anders Bergström, Thomas Booth und Pontus Skoglund

School of Archaeology, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Rick Schulting & Teresa Fernandez-Crespo

Unabhängiger Wissenschaftler, Wells, Großbritannien

Tony Audsley

Oxford Archaeology, Osney Mead, Oxford, Großbritannien

Louise Loe

Mediterranean Laboratory of Prehistory Europe Africa-UMR 7269, Nationales Zentrum für wissenschaftliche Forschung, Universität Aix-Marseille, Marseille, Frankreich

Teresa Fernandez-Crespo

Abteilung für Vorgeschichte, Archäologie, Sozialanthropologie und historiografische Wissenschaften und Techniken, Universität Valladolid, Valladolid, Spanien

Teresa Fernandez-Crespo

Abteilung für Archäologie und neue Technologien, Arkikus, Spanien

Javier Ordoño

Wells & Mendip Museum, Wells, Großbritannien

David Walker

Levens Local History Group, Levens, Cumbria, Großbritannien

Tom Clare, Geoff Cook, Mark Simpson und Stephen Read

School of Biological and Environmental Sciences, Liverpool John Moores University, Liverpool, Großbritannien

Ian Hodkinson

Abteilung für Evolutionsgenetik und Abteilung für Archäogenetik, Max-Planck-Institut für evolutionäre Anthropologie, Leipzig, Deutschland

Mateja Hajdinjak

School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, Großbritannien

Anders Bergström

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Konzeptualisierung: P. Swali, P. Skoglund. Datenkuration: P. Swali, AG Formale Analyse: P. Swali. Finanzierungseinwerbung: RS, P. Skoglund. Untersuchung: P. Swali, RS, AG, MK, MW, JM, KA, IG, TD, M. Silva, MH, AB, TB, P. Skoglund. Projektleitung: P. Swali, RS, TB, P. Skoglund. Ressourcen: RS, TA, LL, TFC, JO, DW, TC, GC, IH, M. Simpson, SR Aufsicht: P. Skoglund. Visualisierung: P. Swali, AG, KA Schreiben – Originalentwurf: P. Swali, P. Skoglund. Schreiben – Rezension und Bearbeitung: P. Swali, RS, MK, KA, TFC, JO, MH, AB, TB, P. Skoglund.

Korrespondenz mit Pooja Swali, Thomas Booth oder Pontus Skoglund.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Swali, P., Schulting, R., Gilardet, A. et al. Yersinia pestis-Genome enthüllen die Pest in Großbritannien vor 4000 Jahren. Nat Commun 14, 2930 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38393-w

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Eingegangen: 21. Januar 2022

Angenommen: 28. April 2023

Veröffentlicht: 30. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38393-w

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