Erzeugung von Gαi-Klopfen

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 112 (2023) Diesen Artikel zitieren

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G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind zentrale Zellmembranproteine, die extrazelluläre Moleküle wahrnehmen und zelluläre Reaktionen aktivieren. Die Familie der G-Protein-α-Untereinheit i (Gαi) stellt den häufigsten GPCR-Kopplungspartner dar und besteht aus acht Untereinheiten mit unterschiedlichen Signaleigenschaften. Allerdings war die Analyse des Kopplungsmusters aufgrund der endogenen Expression der Gαi-Untereinheiten in praktisch allen Zelllinien eine Herausforderung. Hier erzeugen wir eine HEK293-Zelllinie, der alle Gαi-Untereinheiten fehlen, was die Messung der GPCR-Gαi-Kopplung bei vorübergehender Reexpression einer bestimmten Gαi-Untereinheit ermöglicht. Wir profilieren die Gαi-Kopplungsselektivität über 11 GPCRs hinweg, indem wir die ligandeninduzierte Hemmaktivität für die cAMP-Akkumulation messen. Die Kopplungsprofile werden dann in drei Cluster eingeteilt, die diejenigen darstellen, die bevorzugt an Gαz gekoppelt sind, diejenigen an Gαo und diejenigen mit nicht offensichtlicher Selektivität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass einzelne Gαi-gekoppelte GPCRs die Gαi-Signalisierung feinabstimmen, indem sie eine Kopplungspräferenz auf der Ebene der Gαi-Untereinheit ausüben.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die wichtigsten Wandler, die extrazelluläre Reize mit nachgeschalteten intrazellulären Signalen verknüpfen, sind die häufigsten Ziele für die Arzneimittelentwicklung1. Bei der GPCR-Ligandenbindung induzieren die heteromeren Guaninnukleotid-bindenden Proteine ​​(G-Proteine), bestehend aus α-, β- und γ-Untereinheiten, die Aktivierung ihrer Effektorproteine. Von den drei Untereinheiten bestimmt vor allem die α-Untereinheit die Schlüsseleigenschaften einzelner heterotrimerer G-Proteine. Das menschliche Genom kodiert für 16 α-Untereinheiten, die aufgrund ihrer Sequenzhomologie und funktionellen Ähnlichkeit in vier Unterfamilien eingeteilt werden, nämlich Gαs, Gαi, Gαq und Gα122. Die Gαi-Unterfamilie ist der häufigste Kopplungspartner in den GPCRs der Familie A3,4. Darüber hinaus koppeln etwa 45 % der GPCRs, auf die von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Arzneimittel abzielen, an die Gαi-Unterfamilie5, was die Bedeutung von Gαi-gekoppelten GPCRs als Arzneimittelziele unterstreicht.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Gαi-Untereinheiten sowohl überlappende als auch unterschiedliche Funktionen haben. Die Gαi-Unterfamilie besteht aus acht α-Untereinheiten: Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαt1, Gαt2, Gαt3, Gαo und Gαz. Die Aktivierung des Gi-Heterotrimers induziert verschiedene zelluläre Signalprozesse, wie die Hemmung von Adenylylcyclase und Calciumkanälen sowie die Aktivierung von Kaliumkanälen6. Trotz der hohen Sequenzhomologie innerhalb der Gαi-Unterfamilie wurden mehrere untereinheitsspezifische Funktionen berichtet. Beispielsweise sind Transducin (Gαt1 und Gαt2) und Gustducin (Gαt3) an der visuellen bzw. geschmacklichen Wahrnehmung beteiligt, indem sie beide die cGMP-Phosphodiesterase aktivieren7,8. Darüber hinaus wurde mithilfe von Gαi-Untereinheit-Knockdown-Experimenten in GH4C1-Zellen festgestellt, dass Gαo und Gαi2 die Hemmung des Kalziumeintritts bzw. der cAMP-Akkumulation vermitteln9. Die Gαi-Untereinheiten verhalten sich auch biochemisch unterschiedlich voneinander. Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese biochemischen Eigenschaften in lebenden Zellen verändert werden könnten, wie in Gq beobachtet, das im gereinigten Zustand eine langsamere Nukleotiddissoziation zeigt als im Lipidmembranzustand. Beispielsweise ist die Rate der spontanen GDP-Dissoziation von Gαo um eine Größenordnung schneller als die von Gαi1-310, und die intrinsische GTPase-Aktivität von Gαz ist 200-fach langsamer als die der anderen Gαi-Untereinheiten11. Diese Unterschiede zwischen den Mitgliedern der Gαi-Familie ermöglichen eine vielfältige Gαi-gekoppelte GPCR-Signalübertragung.

Obwohl die Signaleigenschaften der Gαi-Untereinheiten gut charakterisiert sind, wurde die Gαi-Untereinheit-Kopplungsselektivität von GPCRs aufgrund experimenteller Schwierigkeiten nur für eine begrenzte Anzahl von Rezeptoren untersucht. Die individuelle GPCR-Gαi-Kopplung kann nicht einfach durch die Expression einer interessierenden Gαi-Untereinheit beurteilt werden, da praktisch alle Säugetierzellen endogen mehrere Gαi-Untereinheiten exprimieren12. Um die endogene GPCR-Gαi-Kopplung zu eliminieren, wurde in früheren Studien Pertussis-Toxin (PTX) verwendet, das den Cysteinrest im C-terminalen Schwanz der Gαi-Untereinheiten ADP-ribosyliert13. Durch die Expression eines PTX-resistenten Gαi-Mutanten mit einer Substitution am Cysteinrest ermöglicht die PTX-Behandlung die Messung der selektiven Kopplung der mutierten Gαi-Untereinheit14,15,16. Eine Veränderung des Cysteinrests kann jedoch die G-Protein-Kopplungsfähigkeiten der α-Untereinheiten beeinträchtigen17,18. Darüber hinaus hemmt PTX Gαz nicht, da es an der PTX-Zielstelle über Isoleucin verfügt19. Kürzlich wurden auf Fluoreszenz- oder Biolumineszenz-Resonanzenergieübertragung basierende Techniken verwendet, um die Kopplung einzelner konstruierter Gα-Untereinheiten zu bewerten20,21. Diese Methoden erfordern jedoch die Insertion von Luciferase oder eines fluoreszierenden Proteins in die α-Untereinheit, und eine solche Modifikation beeinflusst deren biochemische Eigenschaften und die daraus resultierende Kopplungseffizienz22.

In dieser Studie haben wir die experimentellen Schwierigkeiten bei der Messung einzelner intakter Gαi-Untereinheiten umgangen, indem wir genomeditierende Ansätze eingesetzt haben, um einen Gαi-Null-Hintergrund in 293A-Zellen menschlicher embryonaler Niere (HEK) zu etablieren. Durch die vorübergehende Expression eines Paares aus einem GPCR und einer Gαi-Untereinheit von Interesse in den Gαi-defizienten HEK293A-Zellen konnten wir Gαi-Kopplungsprofile in 11 GPCRs erfolgreich charakterisieren und eine physiologisch angemessene Selektivität der Gαi-Untereinheiten für diese GPCRs feststellen.

Um einen Gαi-Null-Hintergrund für die Funktionsanalyse von Kopplungsmustern von Gαi-Untereinheiten zu etablieren, haben wir eine HEK293A-Zelllinie ohne alle Gαi-Untereinheiten generiert. Zunächst haben wir die Expression der Gαi-Untereinheiten in HEK293A-Zellen durch quantitative RT-PCR-Analyse gemessen. Während sieben für die Gαi-Untereinheit kodierende Gene (GNAI1, GNAI2, GNAI3, GNAO1, GNAT1, GNAT2 und GNAZ) exprimiert wurden, war die GNAT3-Expression nicht nachweisbar (Abb. 1a). Um das PCR-Primerpaar für GNAT3 zu validieren, haben wir die GNAT3-Expression in einer Probe von Dünndarmgewebe gemessen und bestätigt, in der GNAT3 bekanntermaßen exprimiert wird 23 (ergänzende Abbildung 1). Als nächstes zielten wir auf die sieben für die Gαi-Untereinheit kodierenden Gene ab, die in HEK293A-Zellen vorhanden sind, und zwar mittels Drei-Runden-CRISPR-Cas9-Mutagenese (Abb. 1b). Wir haben Single-Guide-RNAs (sgRNAs) entwickelt, um die Spaltung doppelsträngiger DNA innerhalb der N-terminalen Hälfte jeder α-Untereinheit zu induzieren. Bei erfolgreicher Einführung von Frameshift- oder Nonsense-Mutationen durch diese sgRNAs wird erwartet, dass mutierte Gene verkürzte Gαi-Untereinheiten unter Eliminierung der c-terminalen α5-Helix produzieren, die für die Rezeptorkopplung verantwortlich ist24. Nach der Transfektion der sgRNA-Konstrukte, der fluoreszenzaktivierten Zellsortierungsisolierung GFP-positiver Zellen und der Expansion der klonalen Zellkolonien wurden die Klone mithilfe der Restriktionsenzymmethode auf Mutationen in den Zielgenen untersucht, wodurch ein Knock-out-Klon erhalten wurde Kandidat (ΔGαi-Zellen) (Abb. 1c). Die Sanger-Sequenzierung der Zielgenomregionen bestätigte, dass die ΔGαi-Zellen in allen Zielallelen Frameshift-Mutationen oder große Insertionen, einschließlich Stoppcodons, tragen (ergänzende Abbildung 2). Die GNAT3-Expression blieb in den ΔGαi-Zellen unentdeckt (ergänzende Abbildung 1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die sieben für die Gαi-Untereinheit kodierenden Gene in den HEK293A-Zellen erfolgreich mutiert wurden, um ihre endogene Expression zu verhindern.

a Quantitative Echtzeit-PCR-Analyse der Gαi-Untereinheiten in den HEK293A-Elternzellen. Balken und Fehlerbalken stellen den Mittelwert bzw. den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von drei unabhängigen Experimenten dar. Jedes Experiment wurde doppelt durchgeführt. Abkürzung: ND, nicht erkannt. b Strategie zur genetischen Inaktivierung der Mitglieder der Gαi-Familie. ∆Gαi-Zellen wurden mittels Drei-Runden-CRISPR-Cas9-Mutagenese erhalten. c Identifizierung des Genotyps des Gαi-mutierten Klons unter Verwendung der Restriktionsenzym-verdaute-Fragment-Methode. Die sgRNA-Ziele wurden PCR-amplifiziert und mit ihren entsprechenden Restriktionsenzymen (RE) behandelt. Verdaute Proben wurden einer Kapillarelektrographenanalyse unterzogen und Pseudogelbilder des Elektropherogramms wurden mit einem DNA-Marker des pUC19/Hpa II-Verdaus sichtbar gemacht. Schwarze und rote Pfeilspitzen zeigen unverdaute bzw. RE-verdaute PCR-Fragmente der Zielstelle an. Beachten Sie, dass es in PCR-Fragmenten der GNAI2- und GNAT1-Gene zwei RE-Stellen gibt und eines der mutierten Allele im GNAI1-Gen durch RE verdaut werden könnte. Abkürzungen: P parental, KO knock-out.

Als nächstes untersuchten wir funktionell das Fehlen von Gαi-Untereinheiten in ΔGαi-Zellen mithilfe eines GloSensor cAMP-Assays. Wir exprimierten den µ-Opioid-Rezeptor (MOR), einen prototypischen Gαi-gekoppelten Rezeptor, zusammen mit dem GloSensor cAMP-Reporter und maßen die cAMP-Spiegel bei Stimulation mit dem Liganden Methionin-Enkephalin (MetEnk) zusammen mit Forskolin. In den Elternzellen wurde die durch Forskolin stimulierte cAMP-Akkumulation in Abhängigkeit von der MetEnk-Konzentration nahezu vollständig gehemmt (Abb. 2a). Im Gegensatz dazu reagierten die ∆Gαi-Zellen überhaupt nicht auf MetEnk, während die exogene Gαi2-Expression ihre Reaktion auf den Liganden wiederherstellte (Abb. 2b). Diese Ergebnisse zeigen, dass die ΔGαi-Zellen keine funktionellen Gαi-Untereinheiten aufweisen, was sie für die Untersuchung der Signalübertragung von Gαi-Untereinheiten geeignet macht.

a, b Konzentrations-Reaktionskurven des GloSensor cAMP-Assays in Eltern- (a) und ∆Gαi-Zellen (b). Eltern- und ∆Gαi-Zellen, die vorübergehend den Glo-22F-cAMP-Reporter mit MOR und Gαi2 exprimierten, wurden mit 10 µM Forskolin zusammen mit den angegebenen Konzentrationen von MetEnk stimuliert. Für jedes Experiment wurde die Forskolin-induzierte cAMP-Akkumulation auf 100 % festgelegt. In beiden Abbildungen stellen Symbole und Fehlerbalken den Mittelwert bzw. SEM von drei unabhängigen Experimenten dar. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Beachten Sie, dass die Fehlerbalken bei vielen Datenpunkten kleiner als die Größe der Symbole sind und daher nicht sichtbar sind.

Um die ∆Gαi-Zellen weiter zu charakterisieren, verglichen wir die Zellproliferation der Eltern- und ∆Gαi-Zellen. Wir beurteilten die Zellproliferation, indem wir die Zellen 48 Stunden nach der Aussaat sammelten und die Anzahl der Zellen zählten. Die Zellproliferation der ∆Gαi-Zellen war innerhalb von 48 Stunden im Vergleich zu der der Elternzellen um 20 % reduziert (ergänzende Abbildung 3). Ähnlich wie die ∆Gαi-Zellen zeigten auch mit PTX behandelte Elternzellen eine 20-prozentige Verringerung der Zellproliferation im Vergleich zu nicht behandelten Elternzellen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Unterdrückung der Zellproliferation in den ∆Gαi-Zellen nicht auf einen klonalen Effekt zurückzuführen ist, sondern auf den Mangel an Gαi-Proteinen am Ziel. Darüber hinaus wurde die verringerte Proliferation in ∆Gαi-Zellen und den PTX-behandelten Elternzellen beide durch Kultivieren der Zellen in mit Kollagen Typ I beschichteten Schalen wiederhergestellt (ergänzende Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass die Unterdrückung der Zellproliferation auf die Schwächung zurückzuführen ist Adhäsion der ∆Gαi-Zellen.

Um zu untersuchen, ob die anderen G-Protein-Signale in den ΔGαi-Zellen beeinflusst würden, wurden die Gs-, Gq- und G12-Signale einzeln bewertet. Wir exprimierten den Gs-gekoppelten Vasopressin-V2-Rezeptor (V2R) oder den Dopamin-D1-Rezeptor (D1R) zusammen mit dem GloSensor-cAMP-Reporter sowohl in den ΔGαi-Zellen als auch in den Elternzellen. Anschließend wurden die Zellen mit ihren Agonisten oder Forskolin stimuliert und ihre cAMP-Akkumulation gemessen. Die Gs-Signalübertragung in den ΔGαi-Zellen war im Vergleich zu der in den Elternzellen verstärkt (Abb. 3a, b). Als nächstes haben wir die Gq- und G12-Signalübertragung über den α-Shedding-Assay des transformierenden Wachstumsfaktors (TGF)25 unter Verwendung von Gq- (H1R und α1A) oder G12- (EP3 und CB1) gekoppelten GPCRs gemessen. Durch die Verwendung von G-Protein-defizienten Zellen haben wir zuvor validiert, dass die durch den getesteten Gq-GPCR (H1R und α1A) und den getesteten G12-GPCR (CB1 und EP3) induzierten TGFα-Ausscheidungsreaktionen ausschließlich von Gq/11 und G12/ abhingen. 13 bzw.3. Jeder GPCR wurde zusammen mit einem mit alkalischer Phosphatase markierten TGFα (AP-TGFα)-Reporter in den ∆Gαi-Zellen und den Elternzellen exprimiert und anschließend auf ihre Liganden-induzierte AP-TGFα-Ektodomänen-Ablösungsreaktion gemessen. Die Gq- und G12-Signalübertragung in den ΔGαi-Zellen war mit der in den Elternzellen vergleichbar (Abb. 3c – f). Diese Daten zeigen, dass die Eliminierung der Gαi-Untereinheiten die Gq- und G12-Signalisierung nicht beeinflusst, die Gs-Signalisierung jedoch verstärkt, möglicherweise aufgrund des Verlusts der Konkurrenz zwischen Gs und Gi in den Adenylylcyclasen.

a, b Konzentrations-Reaktionskurven der Gs-vermittelten cAMP-Akkumulation. Eltern- und ∆Gαi-Zellen, die vorübergehend Glo-22F zusammen mit D1R (a) oder V2R (b) exprimierten, wurden mit den angegebenen Konzentrationen von Dopamin bzw. Arginin-Vasopressin (AVP) stimuliert. c–f Konzentrations-Reaktionskurve der TGFα-Ausscheidungsreaktionen, die durch die Aktivierung von Gq- (H1R (c) und α1A (d)) und G12-gekoppelten Rezeptoren (CB1 (e) und EP3 (f)) im Elternteil und im ∆Gαi induziert werden Zellen. Ein Test-GPCR wurde in den Eltern- und ∆Gαi-Zellen zusammen mit dem AP-TGFα-Reporter exprimiert und die resultierende ligandeninduzierte Reaktion wurde bewertet. In allen Abbildungen stellen Symbole und Fehlerbalken den Mittelwert bzw. SEM von drei unabhängigen Experimenten dar. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Beachten Sie, dass die Fehlerbalken bei vielen Datenpunkten kleiner als die Größe der Symbole sind und daher nicht sichtbar sind.

Darüber hinaus untersuchten wir am Beispiel von MOR, ob Gi-gekoppelte GPCRs in Abwesenheit von Gαi-Proteinen Zugang zu anderen Gα-Proteinen erhalten. Wie in Abb. 2b gezeigt, erhöhte die MOR-Aktivierung cAMP in den ∆Gαi-Zellen nicht, was zeigt, dass es auch in Abwesenheit von Gαi nicht an Gs koppelt. Wir haben mithilfe des TGFα-Shedding-Assays weiter untersucht, ob MOR im Gαi-defizienten Zustand an Gq und G12 koppelt. Wir fanden heraus, dass MOR weder in den Eltern- noch in den ∆Gαi-Zellen eine nachweisbare TGFα-Abspaltungsreaktion zeigte (ergänzende Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass MOR auch in Abwesenheit von Gαi-Proteinen nicht mit Gq und G12 koppelt. Bemerkenswert ist, dass wir die Aktivierung von MOR im TGFα-Shedding-Assay validiert haben, indem wir das chimäre Gαq/i1-Gα-Protein, das an Gi-gekoppelte GPCRs bindet und die Gq-Signalübertragung überträgt, als Positivkontrolle verwendeten (ergänzende Abbildung 4). Während diese Daten belegen, dass MOR nicht an nicht bevorzugtes Gα koppelt, selbst wenn kein bevorzugtes Gα vorhanden ist, können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass sich andere Gi-gekoppelte GPCRs anders verhalten. Daher wird empfohlen, diese Möglichkeit bei der Analyse der G-Protein-Kopplung unter Verwendung der Gα-defizienten Zellen in Betracht zu ziehen.

Wir haben GPCR-Gαi-Kopplungsprofile ausgewertet, indem wir ein Paar interessierender GPCR- und Gαi-Untereinheiten in den ∆Gαi-Zellen exprimiert haben. Wir haben fünf Gαi-Untereinheiten, nämlich Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαo und Gαz, aus den acht Gαi-Untereinheiten für die folgende Charakterisierung ausgewählt, da physiologische Effektorproteine ​​für die übrigen Gαi-Untereinheiten (Gαt1, Gαt2 und Gαt3) bekannt sind cGMP-Phosphodiesterase sein.

Um geeignete Mengen der Plasmide im Assay zu bestimmen, haben wir mehrere Mengen an Plasmiden getestet, die für GPCR- oder Gαi-Untereinheiten kodieren, und Konzentrations-Wirkungs-Kurven verglichen. Zuerst haben wir die Membranexpressionsniveaus von MOR, einem repräsentativen GPCR, der in der Studie verwendet wurde, gemessen, indem wir das MOR-kodierende Plasmid (100 ng Gαi1-Plasmid für alle MOR-Bedingungen) titrierten. Ab einer Plasmiddosis von 8–200 ng (pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen) stiegen die Expressionsniveaus an und ihr Niveau stieg im 1000-ng-Zustand nicht weiter an (ergänzende Abbildung 5a, b). Anschließend haben wir die Gi-vermittelte cAMP-Reaktion mit dem GloSensor-Assay gemessen. Die Konzentrations-Reaktions-Kurve verschob sich mit zunehmender Plasmidmenge nach links und erreichte bei einem Volumen von 200 ng ein Plateau (ergänzende Abbildung 5c). Daher verwendeten wir in den nachfolgenden Experimenten 200 ng der Plasmid-kodierenden Test-GPCRs. Im Fall von Gα haben wir das MOR-kodierende Plasmid auf 200 ng festgelegt und die Plasmidmengen aller fünf Gαi-Untereinheiten von 1 auf 1000 ng um das Zehnfache titriert. Eine Plasmiddosis von 1 ng zeigte eine vernachlässigbare cAMP-supprimierende Wirkung, während eine Plasmiddosis von 10 ng die cAMP-Produktion teilweise inhibierte (ergänzende Abbildung 5d). Plasmiddosen von 100 und 1000 ng hemmten die cAMP-Produktion fast vollständig. Wir stellen fest, dass sich die Konzentrations-Wirkungs-Kurve bei Plasmidvolumina von 10 bis 1000 ng mit zunehmender Plasmiddosis tendenziell nach rechts verschiebt. Zusammen wurden nachfolgende Experimente mit einer Gαi-kodierenden Plasmiddosis von 100 ng durchgeführt.

Da der GloSensor cAMP-Assay überwiegend die Aktivierung von Gαs gegenüber Gαi erkennt, haben wir 11 GPCRs ausgewählt, die an Gαi, aber nicht an Gαs gekoppelt sind, darunter Dopamin-D2-Rezeptor (D2R), Dopamin-D4-Rezeptor (D4R) und Mu-Typ-Opioidrezeptor ( MOR), Somatostatin-Rezeptor Typ 2 (SSTR2), Cannabinoid-Rezeptor 1 (CB1), Lysophosphatidsäure-Rezeptor 1 (LPA1), Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptor 1 (S1P1), Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptor 3 (S1P3), wahrscheinliches G-Protein gekoppelter Rezeptor 34 (GPR34), CC-Chemokinrezeptor Typ 2 (CCR2) und CC-Chemokinrezeptor Typ 5 (CCR5). Endogene Liganden, einschließlich Dopamin, Serotonin, Methionin-Enkephalin, Somatostatin, Lysophosphatidsäure, Sphingosin-1-phosphat, Lysophosphatidylserin, CCL2 und CCL4, wurden für alle entsprechenden GPCRs verwendet, mit Ausnahme von CB1, für das ein hochaffiner synthetischer Ligand (CP-55490) verwendet wurde. wurde verwendet, da endogene Liganden wie Anandamid im Assay schlechte Reaktionen zeigten. Für jeden GPCR haben wir die cAMP-Antworten der fünf Gαi-Bedingungen und einer Gαi-nichttransfizierten Bedingung aufgezeichnet (Abb. 4a, ergänzende Abb. 6). Die Hemmung der cAMP-Akkumulation über titrierte Ligandenkonzentrationen wurde grafisch dargestellt und an eine sigmoidale Konzentrations-Reaktions-Kurve angepasst, aus der die Werte für die halbmaximale Konzentration (EC50) und die maximale Reaktion (Emax) erhalten wurden (Ergänzungstabelle 1). Wir fanden unterschiedliche Muster der Gαi-Untereinheit-Kopplung zwischen den 11 GPCRs. In D2R beispielsweise führten alle getesteten Gαi-Untereinheiten zu äquivalenten Sättigungskonzentrationen (entsprechend den Emax-Werten), aber die Konzentrations-Reaktionskurve im Gαo-exprimierenden Zustand verschob sich nach links, was den Unterschied in den EC50-Werten widerspiegelt. Die beobachtete Gαo-Präferenz von D2R steht im Einklang mit früheren Studien unter Verwendung von Sf9-Zellen und intakten Gαi-Untereinheiten, die zeigten, dass D2R am effektivsten an Gαo koppelt26,27. Bei LPA1 hingegen waren die cAMP-supprimierenden Reaktionen in Sättigungskonzentrationen zwischen Gαi1–3 und Gαo vergleichbar, während die Reaktion bei Gαz geringer war.

a Konzentrations-Reaktionskurven von GloSensor cAMP-Assays in den ∆Gαi-Zellen, die vorübergehend Glo-22F mit bestimmten Kombinationen von GPCR- und Gαi-Untereinheiten exprimieren. Die Zellen wurden mit 10 µM Forskolin zusammen mit den angegebenen Ligandenkonzentrationen stimuliert. Für jedes Experiment wurde die Forskolin-induzierte cAMP-Akkumulation auf 100 % festgelegt. In allen Abbildungen stellen Symbole und Fehlerbalken den Mittelwert bzw. SEM von drei unabhängigen Experimenten dar. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Beachten Sie, dass bei einigen Datenpunkten die Fehlerbalken kleiner sind als die Größe der Symbole. b Schematische Darstellung des Prozesses zur Berechnung der RAi-Werte. c Heatmap der LogRAi-Werte für die 11 GPCRs. Die Farben reichen von Weiß (LogRAi = −1,5) bis Rot (LogRAi = 0). Die Anordnung der Rezeptoren erfolgt nach dem Dendrogramm der hierarchischen Clusterbildung, das aus den Kopplungsprofilen berechnet wurde.

Um die Gαi-Untereinheit-Kopplungsselektivität über Rezeptoren hinweg auf einheitliche Weise zu vergleichen, haben wir einen Parameter berechnet, der als relative intrinsische Aktivität (RAi)28 bekannt ist. Der RAi-Wert ist ein einzelner Parameter, der sowohl EC50 als auch Emax berücksichtigt. Während RAi üblicherweise zur Bewertung der Ligandenverzerrung verwendet wird, haben wir es verwendet, um die Präferenz des Rezeptors für Gαi-Untereinheiten zu bewerten. Für jede Sigmoidkurve haben wir Emax durch EC50 geteilt und die resultierenden Emax/EC50-Werte durch den maximalen Emax/EC50-Wert unter den fünf getesteten Gαi-Untereinheiten normalisiert, um dimensionslose relative Emax/EC50-Werte zu generieren (definiert als RAi, Abb. 4b). Wir haben den RAi-Wert (LogRAi) weiter logarithmisch transformiert und ihn als Gαi-Untereinheiten-Kopplungsindex verwendet. Wir haben eine hierarchische Clusteranalyse angewendet, um die GPCRs zu klassifizieren, und ihren Gαi-Untereinheiten-Kopplungsindex als Heatmap mit einem Clustering-Baum angezeigt (Abb. 4c). Wir haben in der Clusteranalyse drei Gruppen beobachtet. Cluster 1 (S1P1, CCR2, S1P3, D4R und MOR) koppelte effizient an Gαz, gefolgt von Gαi1–3 und Gαo. Cluster 2 (D2R) gekoppelt an Gαo, gefolgt von Gαi1–3, dann Gαz. Cluster 3 (CB1, CCR5, GPR34, SSTR2 und LPA1) zeigte keine Selektivität für bestimmte Gαi-Untereinheiten. Wir haben das auf Gαi-Kopplung basierende Clustering mit phylogenetischen GPCR-Bäumen verglichen. Basierend auf der Aminosäureähnlichkeit und Ligandengruppierung von GPCRdb (https://gpcrdb.org) wurden die getesteten Rezeptoren in Lipidrezeptoren (LPA1, S1P1, S1P3, CB1), Orphan-Rezeptoren (GPR34) und aminerge Rezeptoren (D2R) eingeteilt , D4R), Chemokinrezeptoren (CCR2 und CCR5) und Peptidrezeptoren (MOR, SSTR2). Interessanterweise unterscheidet sich diese Klassifizierung vom kopplungsbasierten Clustering. Diese Ergebnisse legen nahe, dass aus evolutionärer Sicht jeder GPCR individuell eine unterschiedliche Selektivität für die Gαi-Untereinheit erworben hat29.

In dieser Studie haben wir eine Gαi-defiziente HEK293A-Zelllinie, ∆Gαi-Zellen, etabliert, um die Gαi-Untereinheiten-Kopplungspräferenz von GPCRs effektiver zu untersuchen. Forscher haben PTX zuvor verwendet, um endogen exprimierte Proteine ​​der Gαi-Familie zu hemmen. Allerdings sind PTX-unempfindliche Mutanten erforderlich, um die Signalübertragung einzelner Gαi-Untereinheiten unter PTX-behandelten Bedingungen zu beurteilen. Darüber hinaus ist PTX nicht in der Lage, Gαz zu hemmen. Kürzlich wurde festgestellt, dass ein Escherichia coli pertussis-Toxin ähnliches AB5-Toxin namens OZITX alle Proteine ​​der Gαi-Unterfamilie, einschließlich Gαz30,31, hemmt. Auch bei diesem Toxin ist eine Gαi-C-terminale Mutation erforderlich, die die Kopplungseigenschaften beeinträchtigen kann, um Proteine ​​der Gαi-Unterfamilie gegenüber OZITX unempfindlich zu machen. Die ∆Gαi-Zellen überwinden diese experimentellen Probleme und ermöglichen die Untersuchung nicht nur der Kopplung von GPCR-Gαi-Untereinheiten, sondern auch der nachgeschalteten Signalübertragung intakter, einzelner Gαi-Untereinheiten.

Die Kopplungspräferenz von D2R für Gαo sowie D4R für Gαz sorgt für Signaleigenschaften, die für physiologische Funktionen geeignet sind. Gαz hat eine langsame spontane GDP-Dissoziationsrate sowie eine geringe intrinsische GTPase-Aktivität11. D4R wird in der Netzhaut exprimiert und reguliert die zirkadiane Natur des lichtadaptierten Sehens32,33. Sowohl D4R als auch Gαz werden in Photorezeptorzellen exprimiert und zeigen ein tägliches Expressionsmuster, das nachts seinen Höhepunkt erreicht34. Eine effiziente Kopplung von D4R und Gαz kann eine Regulierung der zirkadianen Natur des Sehens ermöglichen, indem die langfristigen Aktivierungseigenschaften von Gαz genutzt werden. Obwohl D2R phylogenetisch D4R am ähnlichsten ist und zusammen D2-ähnliche Rezeptoren umfasst, ist D2R effizient an Gαo gekoppelt. Im Gegensatz zu Gαz weist Gαo eine schnellere spontane GDP-Dissoziationsrate auf als die anderen Gαi-Untereinheiten10. Daher ist es wahrscheinlich, dass D2R über Gαo schnell reagierende Signaleigenschaften besitzt, die eine schnelle Signalübertragung zwischen Neuronen ermöglichen können. Insgesamt nutzen D2R und D4R wahrscheinlich die unterschiedliche Kopplungsselektivität, um eine angemessene Dauer dopaminerger Signalergebnisse zu ermöglichen. Da die Signaleigenschaften von GPCRs auch von den Gα-Expressionsprofilen der Zellen und ihrer Lokalisierung abhängen, die je nach Zelltyp unterschiedlich sind, müssen die Signaleigenschaften von D2R und D4R in vivo in zukünftigen Studien weiter untersucht werden.

MOR ist ein wichtiges Wirkstoffziel für Analgetika. In einer früheren Studie mit PTX und PTX-unempfindlichen Gαi-Untereinheiten war MOR effektiver an Gαi3 und Gαo gekoppelt als an Gαi1 und Gαi214. Unter unseren Versuchsbedingungen koppelt MOR jedoch fast vergleichbar mit Gαi1-3 und Gαo. Obwohl der Unterschied in der Menge an Gα-Proteinen zwischen den beiden Studien auch die Kopplung beeinflussen könnte, könnte dieser beobachtete Unterschied auf die Verwendung der C-terminalen Mutation in den Gαi-Untereinheiten in der vorherigen Studie zurückzuführen sein, um eine Resistenz gegen PTX zu verleihen, was darauf hindeutet Bedeutung der Bewertung der Gαi-Untereinheitsselektivität anhand intakter Gαi-Untereinheiten. Zusätzlich haben wir die Kopplung von MOR für Gαz parallel zu Gαi1-3 und Gαo ohne Modifikationen in den α-Untereinheiten gemessen. In-vivo-Experimente haben gezeigt, dass Mitglieder der Gαi-Familie unterschiedliche Rollen bei der morphininduzierten analgetischen Wirkung spielen: Gαz bei chronischer Verabreichung35,36 und Gαi2 und Gαo bei akuter analgetischer Wirkung37,38. Unter Berücksichtigung voreingenommener Liganden, die eine deutliche Effektoraktivierung am selben Rezeptor induzieren39,40,41, könnte ein Gαz-voreingenommener MOR-Agonist möglicherweise zur Entwicklung einer langwirksamen Analgesie mit möglicherweise geringerer Toleranz führen. Insgesamt könnte die Bewertung der Gαi-Untereinheitsselektivität von MOR-Agonisten letztendlich unser Verständnis der Unterschiede in der Arzneimittelaktivität verbessern und zur Entdeckung wünschenswerterer Analgetika beitragen.

Zusammen mit unseren zuvor generierten ∆Gαs-, ∆Gαq- und ∆Gα12-Zellen42,43,44 verfügen wir nun über einen vollständigen Satz der vier Gα-Knockout-Zelllinien. Diese Zelllinien können verwendet werden, um die Gα-Signalisierung stromabwärts von GPCRs einzeln zu untersuchen, was unser Verständnis der GPCR-Signalisierung45 verbessern und letztendlich die Entwicklung von Arzneimitteln mit optimaleren therapeutischen Wirkungen ermöglichen wird.

MetEnk (4042-v) und Somatostatin (4023-v) wurden vom Peptide Institute erworben. S1P (62570) und CP-55490 (90084) wurden von Cayman Chemical erworben. Dopamin (040-15433) wurde von FUJIFILM Wako Pure Chemical gekauft. LPA (867130) und LysoPS (858143) wurden von Avanti Polar Lipid bezogen. CCL2 (Z03292) und CCL4 (Z02831) wurden von Genscript erworben. Plasmide, die im Glosensor cAMP-Assay3 und im TGFα-Shedding-Assay25 verwendet werden, wurden bereits beschrieben.

HEK293A-Zellen (Thermo Fisher Scientific) und ihre abgeleiteten ΔGαi-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Nissui Pharmaceutical) gehalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 0,006 % (Gew./Vol.) Penicillin und 0,01 % (Gew./Vol.) Streptomycin (vollständiges DMEM) und bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator gehalten, der mit 5 % CO2 äquilibriert ist. Die Transfektionen wurden unter Verwendung einer Polyethyleniminlösung (PEI) (Polyethylenimine „Max“, Polysciences) durchgeführt. Typischerweise wurden HEK293-Zellen in einer Kulturplatte mit 6 Vertiefungen bei einer Zelldichte von 2 × 105 Zellen pro ml in 2 ml des vollständigen DMEM ausgesät und einen Tag lang in einem CO2-Inkubator kultiviert. Eine Transfektionslösung wurde gemischt, indem in 100 µl Opti-MEM (Life Technologies) verdünnte Plasmidlösung und 4 µl einer 1 mg pro ml PEI-Lösung in 100 µl Opti-MEM kombiniert wurden. Die transfizierten Zellen wurden einen Tag lang weiter inkubiert, bevor sie einem wie unten beschriebenen Test unterzogen wurden.

Die ΔGαi-Zellen wurden durch die in Abb. 1B dargestellte iterative CRISPR/Cas9-vermittelte Mutagenesestrategie erhalten. sgRNA-Konstrukte, die auf die Gene GNAI1, GNAI2, GNAI3, GNAO, GNAZ, GNAT1 und GNAT2 abzielen, wurden unter Verwendung der Website CRISPR.MIT.EDU (bereits geschlossen) entworfen, sodass eine SpCas9-vermittelte DNA-Spaltungsstelle (3 bp stromaufwärts der Die PAM-Sequenz (Protospacer Adjacent Motiv) umfasst eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle. Sense- und Antisense-Oligonukleotide, die für die Leit-RNA kodieren, wurden synthetisiert (FASMAC) und in die BbsI-Stelle des Vektors pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) eingefügt (ein Geschenk von Feng Zhang, Broad Institute, Cambridge, MA; Addgene-Plasmid Nr .48138). Die korrekte Einfügung der Guide-RNA-Sequenzen wurde durch Sequenzierung mit der Sanger-Methode (FASMAC) verifiziert. HEK293A-Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät (1,0 × 105 Zellen pro ml in 2 ml komplettem DMEM) und 24 Stunden später mit einer Kombination von PX458-Vektoren, die auf die für die Gαi-Untereinheit kodierenden Gene abzielten, unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) transfiziert. Drei Tage später wurden die Zellen geerntet und die oberen 10–20 % der GFP-positiven Zellen wurden mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (SH800; SONY) isoliert. Die isolierten Zellen wurden zur klonalen Expansion in Platten mit 96 Vertiefungen verteilt. Klone wurden durch PCR und Restriktionsenzymverdauung unter Verwendung eines Kapillarelektrophoresesystems (MultiNA, Shimadzu) auf Mutationen in Zielgenen analysiert. Die gegen Restriktionsenzyme resistenten PCR-Produkte wurden durch direkte Sequenzierung oder TA-Klonierung auf ihre genomischen DNA-Veränderungen untersucht. Das erfolgreiche Targeting wurde durch die Bewertung der GPCR-vermittelten cAMP-Hemmung bestätigt, wie unten beschrieben. Oligonukleotidsequenzen, die Guide-RNAs kodieren, PCR-Primer, die zur Amplifikation der sgRNA-Zielstellen verwendet werden, und die Restriktionsenzyme, die zum Verdau von PCR-Produkten verwendet werden, sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Gesamt-RNA aus HEK293-Zellen wurde mit einem GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich) hergestellt. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Hochleistungs-cDNA-RT-Kits (Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers transkribiert. Quantitative Echtzeit-PCRs wurden mit TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio) durchgeführt und mit ABI Prism 7300 (Applied Biosystems) überwacht. Die RNA-Expressionsdaten wurden auf die Expression von GAPDH normalisiert. Die PCR-Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Die Plasmidtransfektion wurde in einer 6-Well-Platte mit einer Mischung aus 1 µg (pro Well in einer 6-Well-Platte) Glo-22F cAMP-Biosensor-kodierendem pCAGGS-Plasmid (Gen synthetisiert mit Codonoptimierung durch Genscript), 200 ng GPCR- durchgeführt. kodierendes Plasmid und 100 ng des für die Gαi-Untereinheit kodierenden Plasmids. Nach eintägiger Inkubation wurden die transfizierten Zellen mit 0,53 mM EDTA-haltigem D-PBS geerntet, 5 Minuten bei 190 g zentrifugiert und in 0,01 % Rinderserumalbumin (BSA, fettsäurefrei und proteasefrei, Serva) suspendiert ) und 5 mM HEPES (pH 7,4) mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Die Zellen wurden in einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät (30 µl pro Vertiefung) und mit D-Luciferin-Kaliumlösung (10 µl einer 8 mM Lösung pro Vertiefung; FujiFilm Wako Pure Chemical) beladen. Nach zweistündiger Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurde die anfängliche Lumineszenzzahl der Platte abgelesen (Spectramax L, Molecular Devices). Die Zellen wurden mit einem Liganden allein (Gs-Assay) oder 10 µM Forskolin (FujiFilm Wako Pure Chemical) zusammen mit einem Liganden (Gi-Assay) (10 µl 5x-Lösung pro Vertiefung) behandelt. Zur Kinetikmessung wurden die Platten 20 Minuten lang gemessen und als Fold-Change-Werte ausgedrückt. Die Lumineszenzsignale mit mehrfacher Änderung zwischen 16 und 20 Minuten nach der Zugabe der Verbindung wurden gemittelt und auf die Signale im mit Forskolin behandelten Zustand normalisiert. Mithilfe der Prism 9-Software (GraphPad Prism) wurden die cAMP-Signale an eine sigmoidale Konzentrations-Reaktions-Kurve mit vier Parametern angepasst, aus der EC50- und Emax-Werte ermittelt wurden. Die hierarchische Clusterbildung des Kopplungsprofils wurde in Python mithilfe der Ward-Methode durchgeführt.

Der TGFα-Ausscheidungstest wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Änderungen durchgeführt25. Die Plasmidtransfektion wurde in einer Platte mit 6 Vertiefungen mit einer Mischung aus 500 ng (pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen) AP-TGFα-kodierendem Plasmid und 200 ng GPCR-kodierendem Plasmid durchgeführt. Nach einer eintägigen Kultur wurden die transfizierten Zellen durch Trypsinisierung geerntet, durch 5-minütige Zentrifugation bei 190 g pelletiert und einmal mit 5 mM HEPES (pH 7,4) enthaltendem HBSS gewaschen. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in 6 ml HEPES-haltigem HBSS resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen (Zellplatte) mit einem Volumen von 90 µl (im Folgenden pro Vertiefung) ausgesät und 30 Minuten lang in einem CO2-Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden mit einem GPCR-Liganden behandelt (10-fach, verdünnt in HBSS mit 5 mM HEPES (pH 7,4) und 0,01 % (Gew./Vol.) BSA. Nach dem Drehen der Zellplatten wurden 80 µl konditioniertes Medium in eine leere 96 übertragen -Well-Platte (Conditioned Media (CM)-Platte). Insgesamt 80 µl AP-Reaktionslösung (10 mM p-Nitrophenylphosphat (p-NPP), 120 mM Tris-HCl (pH 9,5), 40 mM NaCl und 10 mM MgCl2) wurde in die Zellplatten und die CM-Platten verteilt. Die Absorption der Platten bei 405 nm wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät (SpectraMax 340 PC384, Molecular Devices) vor und nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur gemessen. Ligandeninduzierter AP-TGFα Die Freisetzung wurde berechnet, indem das spontane AP-TGFα-Freisetzungssignal vom ligandeninduzierten AP-TGFα-Freisetzungssignal subtrahiert wurde.

Die Durchflusszytometrieanalyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt3. Die Plasmidtransfektion wurde in einer 6-Well-Platte mit 1 µg (pro Well in einer 6-Well-Platte) Glo-22F, 100 ng Gαi1 und unterschiedlichen Mengen an Plasmid, das für MOR kodiert, das die N-terminale Hämagglutinin-Signalsequenz beherbergt, durchgeführt durch den FLAG-Epitop-Tag und einen flexiblen 15-Aminosäuren-Linker. Die transfizierten Zellen wurden durch Zugabe von 300 µl 0,53 mM EDTA-haltigem D-PBS, gefolgt von 300 µl 5 mM HEPES (pH 7,4) enthaltendem HBSS, geerntet. Die Zellsuspension wurde in einer V-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen verteilt (200 µl pro Vertiefung, zwei Vertiefungen pro Probe). Nach einminütiger Zentrifugation bei 700 g wurden die Zellen einmal mit D-PBS gewaschen und pelletiert. Zellpellets wurden in 2 % Ziegenserum und 2 mM EDTA-haltigem D-PBS (Blockierungspuffer; 100 µl pro Vertiefung) suspendiert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einminütiger Zentrifugation bei 700 g wurden die Zellen 30 Minuten lang auf Eis mit monoklonalem Anti-FLAG-Epitop-Tag-Antikörper (Klon 1E6, FujiFilm Wako Pure Chemicals; 10 µg/ml im Blockierungspuffer; 50 µl pro Vertiefung) gefärbt. Nach dem Spülen mit D-PBS wurden die Zellen 15 Minuten lang auf Eis mit einem Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper markiert, der mit Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 10 µg/ml Verdünnung im Blockierungspuffer; 25 µl pro Vertiefung) konjugiert war . Die Zellen wurden einmal mit D-PBS gewaschen, in 100 µl 2 mM EDTA-haltigem D-PBS resuspendiert und durch einen 40 µm-Filter filtriert. Die fluoreszierend markierten Zellen (ungefähr 20.000 Zellen pro Probe) wurden mit dem EC800-Durchflusszytometer (Sony) analysiert. Das von Alexa Fluor 488 abgeleitete Fluoreszenzsignal wurde in einem FL1-Kanal aufgezeichnet und die Durchflusszytometriedaten wurden mit einer FlowJo-Software (FlowJo) analysiert. Wir haben alle aufgezeichneten Fluoreszenzsignale verwendet und die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) berechnet.

Die Plasmidtransfektion wurde in einer 6-Well-Platte mit einer Mischung aus 500 ng NES-LgBiT-miniGi1-kodierendem Plasmid, dessen Linkerlänge zwischen LgBiT und miniGi1 gegenüber dem ursprünglichen Konstrukt auf 15 Aminosäuren verlängert wurde, und unterschiedlicher Menge durchgeführt C-terminal SmBiT-fusioniertes MOR-Plasmid (mit der N-terminalen Hämagglutinin-Signalsequenz, gefolgt vom FLAG-Epitop-Tag und einem flexiblen 15-Aminosäuren-Linker). Nach einer eintägigen Kultur wurden die transfizierten Zellen mit 1 ml 0,53 mM EDTA-haltigem D-PBS geerntet, gefolgt von der Zugabe von 2 ml HEPES-haltigem HBSS. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 190 g zentrifugiert und in 2 ml des 0,01 % BSA und 5 mM HEPES (pH 7,4) enthaltenden HBSS (Assaypuffer) resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in einer weißen Kulturplatte mit 96 Vertiefungen (Greiner Bio-One) mit einem Volumen von 80 µl (im Folgenden pro Vertiefung) ausgesät und mit 20 µl einer 50 µM Coelenterazin-Lösung (Carbosynth), verdünnt im Testpuffer, beladen. Nach zweistündiger Inkubation mit Coelenterazin bei Raumtemperatur wurde MetEnk (6 µM, verdünnt im Testpuffer) manuell zu den Zellen (20 µl) hinzugefügt. Lumineszenzsignale wurden alle 40 Sekunden nach der Ligandenzugabe gemessen und durchschnittliche Lumineszenzwerte von 10–15 Minuten aufgezeichnet.

Für den GloSensor cAMP-Assay und den TGFα-Shedding-Assay wurden drei unabhängige Experimente in doppelter bzw. dreifacher Ausführung durchgeführt. Für die quantitative RT-PCR-Analyse wurden drei unabhängige Experimente in zweifacher Ausfertigung durchgeführt. Symbole und Fehlerbalken repräsentieren Mittelwerte bzw. SEM der angegebenen Anzahl unabhängiger Experimente. Konzentrations-Reaktionskurven wurden an alle Daten durch die nichtlineare Regression angepasst: Variable Steigung (vier Parameter) im Prisma 9 mit einer Einschränkung der Hügelsteigung mit einem Absolutwert von weniger als zwei. Für die Mehrfachvergleichsanalyse haben wir die statistische Signifikanz mittels Zwei-Wege-ANOVA getestet, gefolgt vom angegebenen Post-hoc-Test mit Prism 9.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle in der Studie generierten oder analysierten Daten werden in den Zusatzdaten 1 bereitgestellt.

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Wir danken Ritsuki Kuramoto von der Tohoku-Universität für seine Unterstützung bei der Clusteranalyse; Ayaki Saito und andere Mitglieder des Inoue-Labors für die Manuskriptbearbeitung; Kazuhiro Kobayashi und Osamu Nureki an der Universität Tokio für das miniGi1-Konstrukt. AI wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) finanziert. KAKENHI gewährt die Zuschüsse 21H04791, 21H05113, JPJSBP120213501 und JPJSBP120218801; FOREST-Programm JPMJFR215T und JST Moonshot-Forschungs- und Entwicklungsprogramm JPMJMS2023 von der Japan Science and Technology Agency (JST); BINDS JP22ama121038 von der japanischen Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED); Takeda Science Foundation; Uehara Memorial Foundation. YO erhielt JSPS KAKENHI 20J20669.

Molekulare und zelluläre Biochemie, Graduiertenschule für Pharmazeutische Wissenschaften, Tohoku-Universität, Sendai, Miyagi, 980-8578, Japan

Yuki Ono, Kouki Kawakami, Gaku Nakamura, Satoru Ishida und Asuka Inoue

Abteilung für Gesundheitschemie, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Universität Tokio, Bunkyo-ku, Tokio, 113-0033, Japan

Junken Aoki

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Konzeptualisierung: YO und AI; Untersuchung: YO, GN, KK und SI; Schreiben: YO, KK und AI mit Feedback aller Co-Autoren. Finanzierungsakquise: YO, JA und AI; Aufsicht: JA und AI

Korrespondenz mit Asuka Inoue.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Bryan Roth, Ajith Karunarathne und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Joao Valente.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ono, Y., Kawakami, K., Nakamura, G. et al. Die Erzeugung von Gαi-Knockout-HEK293-Zellen beleuchtet die Gαi-Kopplungsvielfalt von GPCRs. Commun Biol 6, 112 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04465-2

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Eingegangen: 03. August 2022

Angenommen: 11. Januar 2023

Veröffentlicht: 28. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04465-2

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